1?基因組和基因測序
根據(jù)人類基因組計劃（The Human Genome Project）估計，人類擁有20000-25000個蛋白編碼基因。基因組（genome）指一個生物體所包含DNA的全部遺傳信息。基因組由基因區(qū)域和非編碼區(qū)域組成。人類的基因組大小約為30億個堿基對（bp）（3GB），其中非編碼區(qū)域占到絕大多數(shù)，編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域僅占約2%左右。
外顯子是基因組中能夠轉(zhuǎn)錄組出成熟RNA的部分。一個基因組中所有外顯子的集合，即為外顯子組（exome）。人類擁有約18萬個外顯子，約占人類基因組的1%，即約3000萬個bp（30MB）。通常所說的全外顯子組測序，是指針對蛋白編碼基因的外顯子，很少涉及非編碼基因。
基因（gene）是DNA中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列的總稱，是具有遺傳效應(yīng)的DNA分子片段，是控制生物性狀的基本遺傳單位。人類基因區(qū)間的大小可從數(shù)百個bp至超過200萬個bp不等。
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圖：蛋白編碼基因由內(nèi)含子（非編碼序列）和外顯子（包括編碼序列以及UTR區(qū)域）組成。要翻譯有功能的蛋白，要進(jìn)行以下步驟：基因從DNA轉(zhuǎn)錄為RNA前體，通過剪接形成成熟RNA，成熟RNA序列翻譯成氨基酸鏈，以及蛋白質(zhì)分子的翻譯后修飾。圖源：https://www.britannica.com/science/gene
關(guān)于外顯子，需要注意的一個特殊情況是非翻譯區(qū)（UTR）。在mRNA的兩側(cè)分別存在5'UTR（前導(dǎo)序列）和3'UTR（尾部序列），它們的作用分別是調(diào)控翻譯的啟動和終止。它們由外顯子序列構(gòu)成，但不會被翻譯成氨基酸。所以，并非所有外顯子序列都會被翻譯成氨基酸。
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圖：信使RNA前體（pre-mRNA）中的外顯子。外顯子既包括編碼氨基酸的序列（紅色），也包括不被翻譯的序列（灰色）。?圖源：https://en.wikipedia.org/wiki/Exon
2?全外顯子測序
2.1?簡介
對外顯子組（基因組里的所有外顯子）進(jìn)行測序的方法，即為全外顯子組測序（Whole-Exome Sequencing，WES），也稱為外顯子組測序、全外顯子測序，全外測序等。全基因組測序（Whole-Genome Sequencing，WGS）是對整個基因組進(jìn)行測序。靶向測序（Targeted-sequencing，也稱Panel sequencing）是對選定的基因進(jìn)行測序，通常有幾十個至一千個基因不等。因而，從覆蓋基因組的范圍來說，全基因組測序>全外顯子組測序>靶向測序。全外測序可以視作一種特殊的靶向測序——它靶向的區(qū)域是基因組上的所有外顯子。打個比喻：我們?nèi)ゲ耸袌鲑I菜，菜市場里有豐富多樣的瓜果蔬菜肉類（WGS），任君挑選。我們一般會根據(jù)自己的喜好需求挑選自己喜歡的（WES或者其他定制化panel），如果我們能確定吃飯的客人的喜好，那我們可以直接選擇對應(yīng)的菜品（定制化panel），如果我們不確定客人的喜好，或者吃飯的人多，那我們可能要多選一些菜品，做一大桌，客人喜歡哪個就吃哪個（WES）。
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| SNPs、InDels、CNV、Fusion、SV | | |
(1)SNP: single nucleotide polymorphism，單核苷酸變異；
(2)InDels:insertions,deletions，小片段插入缺失；
(3)CNV:copy-number variations，拷貝數(shù)變異；
(4)Fusion:基因融合；
(5)SV:Structural Variants，結(jié)構(gòu)變異，常指的是那些在染色體水平發(fā)生了較大片段（大小至少為50 bp）的變異 |
2.2?WES的優(yōu)勢
科學(xué)家們可以選擇全基因組測序（WGS）或一種更有針對性的方法，只關(guān)注外顯子，即全外顯子測序（WES），和WGS相比，WES在以下三個方面具有優(yōu)勢(1)時間：與WGS相比，進(jìn)行WES需要的時間更少；(2)數(shù)據(jù)：與WGS相比，WES產(chǎn)生的數(shù)據(jù)集要小得多，對于生物信息學(xué)分析來說更容易管理；2.3?WES技術(shù)適用的臨床人群
??具有非典型性疾病特征，或經(jīng)過多種醫(yī)學(xué)檢測未查明致病原因的患者。??涉及某一臟器或多臟器綜合征的、臨床表型提示涉及單基因疾病的患者。??不明原因體格發(fā)育遲緩、智力發(fā)育遲緩、多神經(jīng)發(fā)育異常、精神狀態(tài)異常的患者。??患專科疾病反復(fù)發(fā)作久治不愈的患者。
2.4?WES的應(yīng)用方向
人類全外顯子組所占基因組比例不超過2%，但它包含了約85%與疾病相關(guān)的變異，因此在研究編碼基因變異層面，全外測序是比全基因組測序更為經(jīng)濟(jì)高效的替代方法。全外測序適用于孟德爾疾病、腫瘤、復(fù)雜疾病等多個研究領(lǐng)域。對于表現(xiàn)出異質(zhì)性的疾病，或者患者表現(xiàn)出多個系統(tǒng)受累的復(fù)雜疾病癥狀時，尤為適合使用全外測序。?
圖：外顯子組僅占整個基因組的不到2%。圖源：https://www.my46.org/intro/whole-genome-and-exome-sequencing
由于外顯子組僅占基因組的不到2%，WES相比于WGS，能夠減少測序費用、提高測序深度、縮短測序周期，從而以更低的成本檢測到更多的低頻變異。而相對于panel測序，WES有著廣闊得多的覆蓋范圍。（1）例如在腫瘤臨床檢測中，尋求肺癌靶向治療的患者通常會先做panel測序，因為與肺癌靶向治療相關(guān)的基因是比較明確的，幾十至一百多個基因的panel測序通常就可以滿足需求。（2）而對于尋求免疫治療的患者，通常會使用全外或大panel測序，來評估腫瘤突變負(fù)荷（Tumor Mutational Burden, TMB），TMB高的患者通常對免疫治療有更好的響應(yīng)。全外測序是業(yè)內(nèi)公認(rèn)的評估TMB的金標(biāo)準(zhǔn)。（3）在腫瘤方面，除臨床檢測外，WES也適用于類似繪制突變圖譜、探索耐藥機(jī)制這樣的研究場景。（4）全外測序也適用于遺傳疾病檢測。遺傳疾病，尤其是單基因遺傳病（又稱孟德爾疾病），種類多，涉及的基因也多。在OMIM數(shù)據(jù)庫中收錄的單基因疾病已有超過5000種，相關(guān)基因已有近4000個。如果要進(jìn)行一次全面的單基因遺傳病的篩查，全外無疑是全面、方便、合適且具性價比的選擇。（5）如果我們只想檢測常見的某十幾種遺傳病，定制panel來進(jìn)行檢測也是可行的，但全外無疑會更具研究價值。隨著新的疾病及其分子機(jī)制被不斷揭示，需要加入解讀列表的基因會越來越多。如果某人接受過全外檢測，數(shù)年后他想看看自己有沒有攜帶新發(fā)現(xiàn)的致病突變，那么他只需要帶著檢測數(shù)據(jù)請一位遺傳咨詢師為他解讀就可以了，而不用再做一次檢測。從這個角度來說，全外從長遠(yuǎn)來看也是更具性價比的。2.4.1 WES應(yīng)用于孟德爾遺傳疾病
人體基因組中直接參與蛋白質(zhì)編碼的區(qū)域稱為外顯子。人類外顯子組序列包括22000多個基因的180000多個外顯子，雖然僅占人類全基因組的1-2%，但約85%的疾病相關(guān)遺傳突變都在這個區(qū)域，涵蓋了與個體表型相關(guān)的大部分功能性變異。2.4.2?WES應(yīng)用于產(chǎn)前診斷
研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠過程中，大約2%～4%的胎兒存在明顯的結(jié)構(gòu)異常，目前常用的染色體核型分析和染色體拷貝數(shù)分析技術(shù)只能為20%左右的這類胎兒提供診斷，還有一半以上的病例未能得到有效的診療。大規(guī)模的前瞻性研究表明，在染色體核型和染色體拷貝數(shù)分析均未見異常的胎兒中，產(chǎn)前WES可將結(jié)構(gòu)異常胎兒的診斷率提高8.5%～10%。而且單基因變異在嬰幼兒期疾病中的占比較高，因此產(chǎn)前WES對于部分嚴(yán)重先天性疾病在孕期的診斷可能發(fā)揮重要的作用。2.4.3?WES應(yīng)用于癌癥研究
WES是對基因組外顯子以及周邊區(qū)域DNA進(jìn)行富集捕獲，然后利用二代測序獲得序列信息，最后結(jié)合外顯子公共數(shù)據(jù)庫和生信分析方法來解釋變異與疾病之間關(guān)聯(lián)的一種技術(shù)。同時WES容易實現(xiàn)大于100X的測序深度，因此WES是高效的發(fā)現(xiàn)人類疾病信息的研究手段。目前WES技術(shù)已被廣泛應(yīng)用在多個方面，其中癌癥研究是最熱門、最復(fù)雜、也是全人類最想攻克的難題。下圖是研究腫瘤外顯子的14個分析內(nèi)容，左邊是比較常見的分析點，右邊是比較新穎的分析點，如突變特征分析、腫瘤突變負(fù)荷分析（TMB）、雜合性缺失分析（LOH）、同源重組缺陷分析（HRD）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定分析（MSI）、新抗原變異分析（HLA）。2.5?WES的局限性
首先，WES對于涉及拷貝數(shù)變異、非編碼區(qū)變異和結(jié)構(gòu)變異的疾病研究不適用。其次，在對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行捕獲時，存在捕獲不均、捕獲偏差等現(xiàn)象，可通過增加測序深度，獲得更多的序列信息進(jìn)行統(tǒng)計分析，盡可能彌補(bǔ)這些偏差。3?檢測項目介紹
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| 檢測先證者(有癥狀)及其父母樣本中核基因組的20000多個基因以及先證者線粒體基因組，檢測變異類型包括SNV、Indel和CNV。家系全外相較于單人全外能有效排除可能遺傳自父母的非致病位點，更方便分析新發(fā)變異 | 輔助醫(yī)生進(jìn)行罕見病、疑難病臨床診斷或輔助排除遺傳因素 |
| 檢測先證者（有癥狀）樣本中核基因組的20000多個基因以及線粒體基因組，檢測變異類型包括SNV、Indel和CNV，并通過一代測序進(jìn)行父母樣本的疑似致病SNV/Indel變異的驗證 | 輔助醫(yī)生進(jìn)行罕見病、疑難病臨床診斷或輔助排除遺傳因素 |
| 檢測先證者（有癥狀）樣本中核基因組的20000多個基因，檢測變異類型包括SNV、Indel和CNV，并通過一代測序進(jìn)行父母樣本的疑似致病SNV/Indel變異的驗證 | 輔助醫(yī)生進(jìn)行罕見病、疑難病臨床診斷或輔助排除遺傳因素 |
| 檢測先證者(有癥狀)及其父母樣本中核基因組的20000多個基因，檢測變異類型包括SNV、lndel和CNV。家系全外相較于單人全外能有效排除可能遺傳自父母的非致病位點，更方便分析新發(fā)變異。 | 輔助醫(yī)生進(jìn)行罕見病、疑難病臨床診斷或輔助排除遺傳因素 |
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參考資料：
1.https://www.my46.org/intro/whole-genome-and-exome-sequencing.
2.https://en.wikipedia.org/wiki/Exon.
3.https://www.britannica.com/science/gene.
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